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Streptocoques du groupe A Streptococcus pyogenes; Le GAAS envahit les lignées cellulaires épithéliales humaines L’échec de la pénicilline à éradiquer le GAS de la gorge des patients, en particulier ceux qui sont porteurs du SGA, a été de plus en plus signalé. Cependant, il n’existe aucune évaluation complète de l’efficacité des antibiotiques utilisés pour traiter le GAZ. Nous avons examiné la viabilité du GAS intracellulaire ingéré après l’exposition des cellules épithéliales aux antibiotiques couramment recommandés pour le traitement des infections à SGA. Méthodes Une lignée cellulaire epitheliale laryngée humaine HEp- a été utilisée Trois techniques ont été utilisées pour étudier l’antibiotique pénicilline V érythromycine, azithromycine, céphalothine et mort induite par la clindamycine: examen par microscopie électronique de coupes ultraminces de GAS ingérés, détermination qualitative de l’antibiotique intraépithélial et évaluation de la coloration intracellulaire de la viabilité du GAS intracellulaire après exposition des cellules épithéliales aux antibiotiquesRésultats GAZ survécu intracellu En revanche, il y avait la mort de GAS ingéré après l’exposition des cellules épithéliales à l’érythromycine ou à l’azithromycine. La microscopie électronique a confirmé un manque de mort cellulaire fragmentation GAS intracellulaire après l’exposition des cellules épithéliales à la pénicilline dans les cellules épithéliales. Contrairement à la pénicilline, la céphalosporine, la céphalosporine et la clindamycine ont été plus efficaces que les inhibiteurs de la pénicilline, mais elles ont été moins efficaces que l’érythromycine ou l’azithromycine. L’échec de la pénicilline à tuer le GAS ingéré peut être lié à un manque d’entrée efficace de la pénicilline dans les cellules épithéliales. Ces observations uniques peuvent avoir des implications cliniques pour la compréhension des transporteurs et des voies respiratoires du SGA. g les infections à GAS

Au cours de la dernière décennie, des études ont démontré que les streptocoques du groupe A Streptococcus pyogenes; Le GAS envahit les lignées cellulaires épithéliales humaines in vitro Au cours de la même période, des études cliniques ont montré que la pénicilline réduisait l’efficacité de la pénicilline dans l’éradication du GAS des gorges des patients Cependant, aucune étude directe n’a été menée. les antibiotiques qui sont le plus souvent recommandés pour traiter les infections des voies respiratoires supérieures entrent dans les cellules épithéliales respiratoires et tuent les GAS ingérés. Ces informations sont potentiellement importantes pour la prise en charge clinique, en particulier si la persistance intracellulaire du GAS joue un rôle pathogénique dans le GAS. La difficulté d’éradication du SGA des voies respiratoires supérieures chez les porteurs utilisant la pénicilline a été documentée, mais jamais totalement expliquée Malgré cela, la recommandation presque universelle de la pénicilline pour le traitement de la pharyngite à SGA est restée essentiellement inchangée Eradication de GAS de la gorge des transporteurs n’a pas été con Cependant, des données publiées récemment indiquent que les GAS ingérés ne sont pas seulement impliqués dans des infections récurrentes, mais qu’ils ont le potentiel d’être disséminés dans tout l’hôte Les données de ces études suggèrent que l’état Nous avons étudié la survie intracellulaire des organismes GAS ingérés après l’exposition aux antibiotiques des cellules épithéliales. Nos résultats, utilisant différentes techniques in vitro, démontrent que la pénicilline ne tue pas efficacement le GAS intracellulaire. En revanche, plusieurs agents antimicrobiens pénètrent facilement dans les voies respiratoires. cellule épithéliale, par exemple, les classes de macrolides / azalides tuent facilement les souches sensibles de GAS

Matériaux et méthodes

Seize souches appartenant aux types M, M, M, M, M, M et GAS ont été utilisées dans des études préliminaires. Sur la base de ces études, les souches suivantes ont été sélectionnées pour un examen plus approfondi: isolat A University of Minnesota no AB, chez un patient présentant une pharyngite non compliquée, un facteur d’opacité OF-négatif, type GAS; isoler A University of Minnesota no AB, chez un patient présentant une pharyngite non compliquée, un GA de type M négatif; et isoler A University of Minnesota no AB, isolé chez un patient présentant une pharyngite non compliquée, un test E de test de susceptibilité au GAS de type M OF positif, de type M; AB Bio-disk a révélé que la CMI de la pénicilline G, de l’érythromycine, de la céphalothine et de l’azithromycine était de μg / mL, μg / mL, μg / mL et μg / mL, respectivement. Pour la souche A, les CMI correspondantes étaient μg / mL , μg / mL, μg / mL et μg / mL, respectivement Pour la souche A, les valeurs correspondantes étaient μg / mL, μg / mL, μg / mL et μg / mL, respectivement. La pénicilline, l’érythromycine et la céphalothine une source commerciale Sigma-Aldrich L’azithromycine a été obtenue grâce à Pfizer Dans certaines expériences, la clindamycine Sigma-Aldrich a également été testée lignées cellulaires lignée cellulaire épithéliale laryngée humaine HEp-ATCC CCL et une lignée cellulaire A de carcinome pulmonaire humain; ATCC CCL ont été utilisés imedix.fr. Les cellules ont été cultivées comme décrit précédemment, avec la modification que le milieu DMEM modifié de Dulbecco sans antibiotique de Dulbecco a été utilisé. Pénétration antibiotique dans les cellules HEp Pour chaque antibiotique, des cellules épithéliales ont été ensemencées sur des boîtes de Pétri. Les cellules DMEM ont été cultivées pendant h en présence de μg / mL, μg / mL et μg / mL de chaque antibiotique testé. Les cellules ont été trypsinisées et centrifugées à min / min pendant une minute, remises en suspension dans du PBS salin tamponné au phosphate et centrifugées. les cellules HEp, le culot a été remis en suspension dans des ul de froid Triton X- et incubé pendant min à – ° C Après centrifugation, des ul des surnageants résultants ont été déposés sur des géloses au sang gélose Columbia avec du sang de mouton sur lequel une Les plaques ont été incubées en% de CO pour l’essai de détection et la coloration vivante / morte. Un total de x cellules / ml ont été ensemencées sur des lamelles de verre de DMEM Le Le milieu de culture a été remplacé par du milieu DMEM tamponné par Hepes contenant du sérum de veau fœtal. Des cultures d’isolats GAS A ou A ont été cultivées dans du bouillon de soja tryptique contenant du sérum de veau foetal en ml de tubes Falcon en ° C. Les culots bactériens ont été remis en suspension dans ajusté avec du PBS à une transmission de nm. 20 ul de la suspension ont été ajoutés à chaque lamelle. Après h, les lamelles ont été lavées avec Hepes-DMEM pour éliminer les bactéries non adhérentes Puis, chaque antibiotique testé a été ajouté à une concentration de μg / mL. une autre h, l’étape de lavage et l’addition d’antibiotique ont été répétées après h d’infection, les lamelles ont été lavées deux fois dans du PBS et colorées avec le kit de coloration « live / dead » LIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability Kits; Molecular Probes Europe BV pour min dans l’obscurité à température ambiante, puis lavé avec du PBS et fixé avec du formaldéhyde% dans du PBS pour min à température ambiante avant le montage Les échantillons ont été examinés avec un microscope confocal BioRad MRCUV en utilisant les nm et nm d’un Pour l’analyse morphologique de monocouches infectées par le GAS, des cellules épithéliales ont été ensemencées sur des boîtes de Pétri-cm et cultivées comme décrit précédemment. Le test d’infection a été effectué en ajoutant un μL de la dose ajustée à l’aide d’un microscope électronique à laser. suspension bactérienne en mL de milieu Hepes-DMEM Après h d’infection, des échantillons ont été fixés avec une solution contenant du formaldéhyde% et du glutaraldéhyde en% dans le cacodylate tampon mol / L cacodylate; mol / L CaCl; mol / L MgCl; mol / L de saccharose; pH, pour h sur de la glace et lavé avec du tampon cacodylate; les échantillons ont ensuite été incorporés Des coupes ultraminces ont été coupées avec un couteau en diamant, ramassées avec des grilles de cuivre et contre-colorées avec du citrate de plomb pendant quelques minutes avant d’être examinées avec un microscope électronique à transmission Zeiss EM à une tension d’accélération de kV

Résultats

Les souches incluses dans cette étude ont envahi les cellules HEp avec une efficacité différente. Certaines souches sont restées dans les cellules pour & gt; h sans les détruire, alors que d’autres perturbaient les cellules après quelques heures Pour une évaluation plus détaillée, nous avons sélectionné les souches qui ont envahi le HEp- avec une grande efficacité et entraîné la mort des cellules dans un laps de temps qui nous a permis de expériences Dans les expériences initiales, les cellules HEp ont été infectées avec la souche A du GAS puis exposées à la pénicilline V ou μg / mL d’érythromycine à différents intervalles de temps. La couche confluente a été détruite après l’exposition à la pénicilline, alors que l’érythromycine La pénicilline n’a pas tué le GAS ingéré, le GAS intracellulaire encore viable a entraîné la mort des cellules HEp. La pénétration intracellulaire de l’érythromycine a entraîné la mort du GAS ingéré, permettant ainsi plus de survie des cellules HE avec le temps

Figure Vue largeTélécharger les effets de la pénicilline PCN et de l’érythromycine ERY sur les streptocoques du groupe A intériorisés dans des couches de cellules HEp confluentes en culture tissulaireForme de vueTélécharger les effets de la pénicilline PCN et de l’érythromycine ERY sur les streptocoques du groupe A internalisés dans les couches de cellules HEp confluentes en culture tissulaire ont étudié la morphologie des souches de GAS ingérées après l’exposition aux antibiotiques au sein de la figure cellulaire épithéliale. Les cellules HEp ont été autorisées à envahir les cellules HEp et les cellules HEp ont ensuite été exposées à l’antibiotique Six h après l’infection aux cellules HEp par le GAAS. exposition à la pénicilline V, les streptocoques intracellulaires présentaient un aspect morphologique normal compatible avec la viabilité du SGA. Cependant, avec l’exposition à l’azithromycine ou à l’érythromycine, le SGA était sensible à ces cellules HEp infectées par des antibiotiques. bactéries en forme et enveloppes cellulaires dépourvues de c ytoplasme; données non montrées Cette observation est cohérente avec la perte de viabilité du GAS ingéré. D’intérêt, le GAS intracellulaire exposé aux céphalothines n’a révélé qu’une destruction intracellulaire limitée par rapport au pourcentage de GAS ingéré tué après une exposition à l’érythromycine. Une souche A de GAS résistante à l’érythromycine a été utilisée comme le contrôle n’a pas été tué par l’érythromycine; morphologiquement, les organismes étaient inchangés et ressemblaient à du GAS intracellulaire exposé à la pénicilline

Figure Vue largeDownload slideLes effets de la pénicilline PCN, de la céphalothine CEPH et de l’azithromycine AZI qui ont été ajoutés aux milieux de culture cellulaire sur la morphologie des streptocoques du groupe A ingérés par les cellules HEp, μmFigure Voir en grand diaporama Les effets de pénicilline PCN, céphalothine CEPH et azithromycine AZI qui ont été ajoutés aux milieux de culture cellulaire sur la morphologie des streptocoques du groupe A ingérés par les cellules HEp. Des expériences supplémentaires ont été effectuées pour confirmer la présence intracellulaire de l’antibiotique. Les cellules HEp non infectées ont été exposées à plusieurs concentrations d’antibiotiques. Lyse cellulaire avec Triton X-, des gouttes de fractions solubles intracellulaires séparées ont été déposées sur une pelouse précédemment ensemencée de souche A sensible à l’érythromycine et également sur d’autres plaques d’agar avec une pelouse ensemencée de souche A résistante à l’érythromycine GAS

Figure Vue largeDownload slideLes effets des fractions solubles de la cellule HEp sur les streptocoques du groupe A indiquent une croissance de la souche sur les pelouses après une exposition préalable des cellules HEp aux antibiotiques à différentes concentrations A, cellules HEp non exposées aux antibiotiques; B, HEp- cellules exposées à μg / mL de l’antibiotique; C, HEp- cellules exposées à μg / mL de l’antibiotique; et D, HEp- cellules exposées à μg / mL de l’antibiotique. View largeTélécharger les effets des fractions solubles dans les cellules HEp sur les streptocoques du groupe A sur des pelouses après une exposition préalable des cellules HEp aux antibiotiques à différentes concentrations A, HEp – des cellules non exposées aux antibiotiques; B, HEp- cellules exposées à μg / mL de l’antibiotique; C, HEp- cellules exposées à μg / mL de l’antibiotique; et D, HEp- cellules exposées à μg / mL de l’antibiotique. Après exposition de ces cellules HEp à l’érythromycine ou à l’azithromycine, le contenu intracellulaire de ces cellules a entraîné une absence de zone de croissance de GAS sur la pelouse streptococcique sans hémolyse. ; En revanche, lorsque la pénicilline a été testée de manière similaire, la teneur intracellulaire n’interdisait pas la croissance du GAS sur la pelouse, ce qui correspond à peu ou pas de pénicilline intracellulaire dans les cellules épithéliales après HEP. – L’exposition cellulaire à la céphalothine, le contenu intracellulaire a entraîné une croissance réduite mais pas totalement absente de GAS sur la pelouse. Ceci est compatible avec un effet léthal limité par céphalothine intracellulaire. Les expériences de contrôle avec la souche A du GAS résistante à l’érythromycine n’ont eu aucun effet sur la Contenu intracellulaire contenant du macrolidePour éliminer l’artefact de traitement en laboratoire comme cause de l’inhibition de la croissance du gazon, on a lysé des cellules HEp non préalablement exposées à l’antibiotique et on a étudié l’effet antistreptococcique du contenu intracellulaire sans antibiotique sur chaque pelouse. était pas d’inhibition de la croissance de GAS sur l’un de ces cont rol pelouses, indiquant que les zones observées de croissance inhibée au cours des expériences décrites précédemment ont été causées par les antibiotiques test et ne représentaient pas artefact Dans un troisième ensemble d’expériences visant à confirmer la viabilité de GAS ingérés après l’exposition aux cellules épithéliales infectées par le GAS. En revanche, l’exposition des cellules HEp infectées par le GAS à l’érythromycine ou à l’azithromycine a entraîné la destruction presque totale de la souche A sensible au GAS intracellulaire sensible à l’érythromycine; On observe seulement des cocci morts tachés de rouge Lorsqu’une souche A résistante aux macrolides / azalides est étudiée de manière similaire dans une expérience de contrôle, aucun effet létal essentiel – que ce soit par l’érythromycine ou par l’azithromycine – n’est évident; Dans d’autres expériences après une exposition similaire à la céphalothine, des GAS intracellulaires vivants et morts sont visibles dans approximativement un rapport: Des résultats similaires à l’exposition à la céphalothine ont été obtenus avec la clindamycine.

Figure Vue largeDownload slideLive / mort coloration des streptocoques intracellulaires du groupe A ingérés précédemment suite à l’exposition aux antibiotiques précédente des cellules HEp Les cocci verts sont vivants; les cocci rouges ne sont pas viablesFigure View largeDownload slideLive / mort des streptocoques intracellulaires du groupe A ingérés précédemment suite à l’exposition antérieure aux antibiotiques des cellules HEp Les cocci verts sont vivants; les cocci rouges ne sont pas viables Ce troisième groupe d’expériences a confirmé les expériences précédentes; le résultat était également compatible avec l’absence de pénétration de la pénicilline dans les cellules HEp, la pénétration de l’érythromycine et de l’azithromycine dans les cellules HEp, et un effet intracellulaire limité de la céphalothine

Discussion

la céphalothine n’a pas eu d’effet létal. La céphalothine et la clindamycine ont également tué le GAS ingéré mais ont été moins efficaces que l’érythromycine ou l’azithromycine. Le résultat «intermédiaire» obtenu lorsque la céphalothine de la première génération de céphalosporine Il a été suggéré que les céphalosporines pourraient être plus efficaces pour éradiquer le SGA des voies respiratoires supérieures que la pénicilline Nos résultats qualitatifs in vitro comparant les effets des antibiotiques β-lactamines pénicilline vs céphalothine sont compatibles avec cette possibilité. Des études supplémentaires et plus quantitatives sont nécessaires pour la confirmation. Nous avons également étudié une autre lignée cellulaire épithéliale A; Les résultats ont été similaires à ceux obtenus avec la lignée cellulaire épithéliale laryngée humaine Données HEp non montrées Des études ont également été réalisées avec plusieurs autres antibiotiques en utilisant ⩾ de ces techniques Les études avec une pénicilline semisynthétique ont eu des résultats similaires à ceux obtenus avec des résultats de pénicilline Clindamycine étaient compatibles avec la pénétration dans les cellules épithéliales données non montrées Le fait que le SGA viable tue la cellule épithéliale hôte semblerait contredire l’hypothèse que les streptocoques intracellulaires sont responsables de l’état de porteur Cependant, les résultats préliminaires de l’étude obtenus avec de nombreuses souches et les données publiées ont montré que la capacité de détruire la cellule hôte est dépendante de la souche Il a été démontré qu’il existe des souches capables de survivre longtemps dans les cellules épithéliales sans les détruire Les données de ces études ont une importance clinique et pathogénique potentielle Cette cellule épithéliale les lignes ont la capacité d’ingérer Le GAS a été rapporté par plusieurs laboratoires Nos études antérieures ainsi que celles de LaPenta et al et Sela et al ont décrit que Marouni et al ont également présenté des données limitées sur le fait que les GAS intracellulaires ne sont pas éradiqués. traitement pénicillinique prolongé seulL’importance clinique potentielle de nos observations concerne la probabilité que l’ingestion in vitro de GAS par les lignées cellulaires épithéliales soit similaire à celle qui se produit dans l’état porteur de l’appareil respiratoire supérieur chez le humain. Nos observations de l’internalisation du GAS par épithélium les cellules et l’effet tueur inadéquat par la pénicilline sont compatibles avec les observations publiées d’éradication réduite de la pénicilline du GAZ des voies respiratoires supérieures des porteurs de GAZ des voies respiratoires supérieures Ainsi, ces observations in vitro pourraient suggérer une approche plus efficace pour la gestion clinique des antibiotiques. les données peuvent également avoir des implications cliniques supplémentaires Données publiées avec une souris GAS infectée Les observations cliniques fréquentes montrent que de nombreux patients qui développent une fasciite nécrosante au SGA et / ou un syndrome de choc toxique au SGA n’ont pas de lésion d’entrée sur le sous-jacent ou à proximité de celui-ci. Par conséquent, ces études chez la souris impliquent la nécessité d’éradiquer complètement tous les GAS intracellulaires et extracellulaires chez les patients grâce à l’utilisation d’antibiotiques qui ont le même effet que les leucocytes polymorphonucléaires. Nos données suggèrent également que la céphalosporine de première génération, la céphalothine, pourrait être – au moins qualitativement – un peu plus efficace que la pénicilline pour tuer le SGA intracellulaire in vitro. ceci est une explication partielle de l’observatio n que certains ont rapporté des taux d’éradication du SGA plus élevés chez les patients des voies respiratoires supérieures à la suite d’un traitement par la céphalosporine qu’après un traitement à la pénicilline ne peut être déterminé uniquement à partir de nos observations in vitro. Cependant, les données ne doivent pas être interprétées comme indiquant que les macrolides ou les azalides sont cliniquement plus efficaces pour éradiquer le SGA des voies respiratoires supérieures. Les cliniciens doivent garder à l’esprit que les taux locaux de résistance aux macrolides restent assez importants dans de nombreuses communautés, en particulier en Amérique du Nord. En résumé, ces études in vitro fournissent des données qui indiquent que le GAS ingéré par les cellules épithéliales d’origine humaine n’est pas efficacement tué lorsque les cellules épithéliales contenant du GAS sont exposées à des concentrations même élevées de pénicilline dans les milieux environnants. aux résultats obtenus à la suite de l’exposition au GAS cellules épithéliales à l’érythromycine macrolide ou à l’azithromycine azalide Les implications pourraient être pertinentes à la fois pour les soins aux patients et pour les directives de santé publique pour la gestion de l’état de porteur des voies respiratoires supérieures GAS

Remerciements

Nous souhaitons remercier tout particulièrement Christine Langnau pour son soutien technique et Dwight Johnson pour son assistance dans la fourniture de souches streptococciques du groupe A utilisées dans ces études. Soutien financier Pfizer, Centre de Recherche GBF-Biotechnologie et Deutsche Forschung Gemeinschaft RO / – aux conflits MRPotential de Bien que l’azithromycine utilisée dans ces études in vitro ait été fournie par Pfizer, et bien que Pfizer ait accordé un soutien partiel pour ces études, le personnel de Pfizer n’a joué aucun rôle dans la conception ou la mise en œuvre de l’étude. l’entreprise participe à tout aspect de l’analyse des données ou de la rédaction ou de l’édition de ce manuscrit. Le personnel de Pfizer n’a pas vu ou revu ce manuscrit