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Les récepteurs P2X sont un groupe de complexes de protéines membranaires homo / hétéro-trimériques avec une intégrale. canal ionique qui s’ouvre sur la liaison de l’adénosine triphosphate (ATP) extracellulaire (North, 2002, Khakh et North, 2006). Il y a sept sous-unités P2X (P2X1-P2X7), toutes ayant une topologie membranaire des terminaisons cytosoliques N et C et deux segments transmembranaires (TM1 et TM2) reliés par un grand domaine extracellulaire (Figure 1A; ; Jiang L.-H. et al., 2013) .Pendant l’application de l’ATP pendant quelques secondes, les récepteurs P2X fonctionnent comme des canaux ioniques ligand-dépendants sélectivement perméables aux petits cations physiologiques tels que Ca2 +, Na + et K +, exception du récepteur P2X5 humain qui présente une perméabilité significative au Cl (Bo et al., 2003). La mutagenèse dirigée et les études fonctionnelles des récepteurs P2X de mammifères, en plus de la détermination des structures cristallines des récepteurs P2X4 du poisson-zèbre dans le apo, état fermé et état ouvert lié à l’ATP, ont défini la base structurelle de la liaison de l’ATP, de la perméation ionique et de l’ouverture des canaux (Kawate et al., 2009, Browne et al., 2010, Hattori et Gouaux, 2012). -H et al., 2013, Jiang R. et al., 2013) Trois poches de fixation ATP e est situé aux interfaces des sous-unités (figure ​ (figure 1B), 1B), chacune étant constituée de résidus hautement conservés provenant de deux sous-unités adjacentes. L’occupation de ces sites par l’ATP ou ses analogues agonistes synthétiques induit des changements conformationnels du domaine extracellulaire qui ouvrent la voie de perméation d’ions formée par trois TM2 (Figures 1C, D). La partie la plus étroite de la voie perméatrice d’ions ou la porte physique est fournie par A347 et L351 dans les structures cristallines du récepteur P2X4 du poisson-zèbre (Hattori et Gouaux, 2012) ou les résidus correspondants S342 et L346 dans les modèles structuraux du P2X7 humain et du rat. récepteurs (figure ​ (figure 1D) 1D) (Bradley et al., 2011; Browne et al., 2013; Jiang L.-H. et al., 2013). Figure 1: Modèles structuraux du canal ionique humain P2X7 dans l’état fermé et ouvert. (A, B) Les modèles structurels du récepteur humain trimérique P2X7 à l’état fermé (A) et ouvert (B), vu parallèlement à la membrane plasmique. Ils sont générés sur la base … Il est bien connu qu’une application prolongée de l’ATP pour activer les récepteurs P2X pendant des dizaines de secondes ou minutes induit une augmentation remarquable de la perméabilité membranaire aux grosses molécules jusqu’à 900 Daltons, un phénotype souvent appelé comme la formation de grands pores. Cela a été documenté à l’origine dans les cellules immunitaires il y a environ trois décennies; ATP perméabilisent les membranes cellulaires aux nucléotides (Cockcroft et Gomperts, 1979) et le colorant fluorescent cationique éthidium dans les mastocytes (Gomperts, 1983), ou les colorants organiques anioniques lucifer jaune et carboxyfluorescéine dans les mastocytes et les macrophages (Bennett et al., 1981; Steinberg et Silverstein, 1987). Ces cellules immunitaires expriment le récepteur P2Z précédemment nommé, qui est maintenant connu sous le nom de récepteur P2X7, et l’expression hétérologue des récepteurs P2X7 conférant la formation de grands pores induite par l’ATP (Surprenant et al., 1996). Une telle formation importante de pores a également été observée pendant une activation prolongée d’autres récepteurs P2X comprenant les récepteurs P2X2, P2X2 / 3, P2X2 / 5 et P2X4 (Khakh et al., 1999, Virginio et al., 1999a, b, Compan et al. , 2012). Des efforts considérables ont été consacrés à la compréhension de la formation de grands pores dépendants des récepteurs P2X, mais il a été difficile d’interpréter dans un mécanisme unifié tous les résultats d’études examinant différents récepteurs dans différents types cellulaires avec différents niveaux d’expression des récepteurs. Deux mécanismes ou hypothèses distincts ont été proposés (North, 2002, Pelegr &#x000ed, n, 2011, Jiang L.-H. et al., 2013). La première est que l’activation persistante des récepteurs P2X induit une dilatation de la petite voie de pénétration des ions. Le second mécanisme alternatif est qu’une protéine membranaire séparée interagit avec le récepteur P2X et forme les pores larges lors de l’activation des récepteurs P2X. Par exemple, il a été montré que la pannexine-1 forme de larges pores associés à l’activation du récepteur P2X7 (Pelegrin et Surprenant, 2006). Deux approches expérimentales sont couramment utilisées pour étudier la formation de grands pores dépendants des récepteurs P2X. L’approche biophysique consiste à fixer par patch-clamp les courants induits par les agonistes, Na + et N-méthyl-D-glucamine (NMDG +) étant respectivement le cation dans les solutions intracellulaires et extracellulaires (Surprenant et al., 1996, Khakh et al., 1999). Virginio et al., 1999a, b).Dans de telles conditions bi-ioniques, si la membrane cellulaire est maintenue à un potentiel négatif, l’activation des récepteurs P2X induit initialement des courants vers l’extérieur dont l’amplitude diminue à mesure que l’activation du récepteur continue. En quelques dizaines de secondes, ces courants sortants se transforment en courants internes. Le potentiel d’inversion actuel présente un déplacement progressif vers la direction la moins négative (exemples: Surprenant et al., 1996; Khakh et al., 1999; Virginio et al., 1999a, b; Bo et al., 2003; Jiang et al. ., 2005). Si l’on suppose que les concentrations de cations intracellulaires et extracellulaires restent inchangées pendant l’enregistrement par patch-clamp, le changement du potentiel d’inversion de courant peut être interprété comme une augmentation de la NMDG + perméabilité de la membrane cellulaire, à savoir le canal ionique ouvert est faiblement perméable à NMDG + au début de l’activation du récepteur, mais augmente significativement sa perméabilité NMDG + lorsque l’activation du récepteur continue. Une telle interprétation a conduit à l’hypothèse de la dilatation des pores (Virginio et al., 1999a, North, 2002). En plus des récepteurs P2X, cette approche biophysique a été utilisée pour montrer des augmentations de la perméabilité au cours de l’activation d’autres canaux ioniques tels que TRPV1 (Chung et al., 2008; Samways et al., 2008; Munns et al., 2015) et TRPA1 (Chen et al., 2009). La seconde méthode consiste à utiliser la microscopie par fluorescence ou un système de détection de fluorescence pour surveiller l’accumulation intracellulaire induite par agoniste de colorants de fluorescence tels que YO-PRO-1 et l’éthidium, ou encore la perte progressive induite par agoniste de colorants fluorescents préchargés tels que comme calcein (exemples d’enregistrements, voir Surprenant et al., 1996, Virginio et al., 1999a, b, Jiang et al., 2005, Sorge et al., 2012). Les mesures d’absorption (ou de perte) de colorant sont souvent effectuées dans des solutions plus physiologiques contenant des concentrations micromolaires de colorant fluorescent et, en général, évitent les complications associées à l’élimination complète des cations physiologiques extracellulaires. Un exemple bien documenté de telles complications est que les canaux ioniques P2X7 et P2X2 / 5 activés dans des solutions extracellulaires contenant NMDG + étaient en quelque sorte piégés dans un état ouvert et ne retournaient pas à l’état fermé même quelques minutes après l’arrêt de l’agoniste (Jiang et al., 2005, Yan et al., 2008, Compan et al., 2012). Par conséquent, les résultats des mesures de l’absorption du colorant de fluorescence sont d’une pertinence beaucoup plus biologique. L’amplitude et la vitesse d’absorption du colorant par fluorescence sont significativement indicatives de la formation de larges pores (par exemple, Roger et al., 2010; Browne et al., 2013). Il a été supposé dans des études précédentes, que le récepteur P2X Les grands pores dépendants servent de voie commune pénétrant NMDG + et l’absorption de colorant fluorescent. Cependant, ceci a été remis en question dans une étude antérieure examinant le récepteur P2X7 de rat exprimé de manière hétérologue dans des cellules de rein embryonnaire humain (HEK) 293 (Jiang et al., 2005). L’étude a montré que l’activation prolongée du récepteur P2X7 dans des solutions extracellulaires contenant du Na + induisait une absorption de colorant YO-PRO-1 robuste mais, étonnamment, aucune augmentation du PNMDG / PNa. En outre, l’étude a révélé que l’élimination d’un microdomaine riche en cystéine dans la partie proximale de l’extrémité C-terminale intracellulaire a presque complètement aboli le potentiel de renversement de potentiel d’inversion agoniste dans des conditions bi-ioniques sans compromettre l’absorption de YO-PRO-1 induite par agoniste. En fait, par rapport au récepteur de type sauvage, l’expression du récepteur de délétion mutant a entraîné une capture plus élevée de YO-PRO-1 dans des solutions contenant du Na + et du NMDG + (Jiang et al., 2005). Ces deux lignes de preuves indépendantes s’opposent fortement à l’idée qu’un même mécanisme moléculaire est utilisé pour médier l’entrée à la fois de NMDG + et de YO-PRO-1 dans la cellule. Dans les cellules HEK293 exprimant hétérologiquement le récepteur P2X2 du rat, une étude récente a montré que l’activation de l’ATP du récepteur P2X2 dans des solutions extracellulaires contenant du Na + n’induisait aucune augmentation du PNMDG / PNa (Li et al., 2015). L’étude a élégamment introduit un modèle de réservoir pour soutenir la notion que le changement de potentiel d’inversion vient simplement de la réduction substantielle de la concentration intracellulaire de Na + et de l’augmentation de la concentration intracellulaire de NMDG + pendant l’ouverture prolongée du canal ionique P2X2. Dans leur modèle, le canal ionique P2X2 est perméable à NMDG +, bien qu’avec le PNMDG / PNa de 0,05, mais il n’y a pas besoin d’augmenter la perméabilité NMDG +, en d’autres termes, pas de dilatation des pores! L’étude a démontré que le canal ionique ouvert P2X2 imprègne NMDG + aussi rapidement que les petits cations comme le Na +, mais pas aussi facilement que les derniers ions. Les canaux ioniques ouverts P2X7 présentent également une perméabilité NMDG + extrêmement faible, voire nulle (PNMDG / PNa ~ 0,03-0,04, Virginio et al., 1999a, Jiang et al., 2005).La modélisation structurelle basée sur la structure d’état ouverte du récepteur P2X4 du poisson-zèbre (Hattori et Gouaux, 2012) positionne le C α atomes de trois résidus S342 dans la grille physique de la voie de perméation d’ions comme étant 6.4 Å à partir de l’axe central dans les récepteurs P2X7 à la fois du rat et de l’humain (Browne et al., 2013; Jiang L.-H. et al., 2013; Figure ​ Figure 1D) .1D). NMDG + a une taille de 6 Å × 6 Å × 12,5 Å Ainsi, comme proposé dans une étude récente (Browne et al., 2013), les canaux ioniques ouverts P2X7 peuvent être suffisamment larges pour pénétrer NMDG +. Les colorants fluorescents couramment utilisés sont, cependant, considérablement plus grands que NMDG +, par exemple YO -PRO-1 (7 Å × 8 Å × 19 Å) et d’éthidium (6.5 Å × 11 Å × 13 Å) (Browne et al., 2013). Comment les colorants fluorescents passent-ils à travers la membrane cellulaire, également à travers la voie de perméation d’ions? Des études antérieures ont montré une absorption de YO-PRO-1 après activation des récepteurs P2X2, P2X2 / 3 et P2X4 (Khakh et al., 1999, Virginio et al., 1999b). Les canaux ioniques ouverts de ces récepteurs, s’ils permettent le passage de YO-PRO-1, doivent s’ouvrir beaucoup plus largement que la voie de perméation ionique susmentionnée révélée dans la structure ouverte du récepteur P2X4 du poisson-zèbre (Hattori et Gouaux, 2012) . Une telle possibilité reste à tester. Une étude récente a examiné si le canal ionique du rat P2X7 était capable de pénétrer de grandes molécules, y compris les colorants fluorescents cationiques YO-PRO-1 et l’éthidium, le colorant fluorescent anionique fluorescéine isothiocyanate (FITC; 8,5 Å × 11 Å × 14.5 Å) et le 2-aminoéthyl méthanethiosulfonate modificateur de cystéine neutre (MTSEA; 5 Å × 5 Å × 10 Å) , MTSEA-biotine (7.5 Å × 8 Å × 18.5 Å) et MTS-rhodamine (9 Å × 14 Å × 16,5 Å) (Browne et al., 2013). Les courants ioniques induits par l’ATP et l’absorption de YO-PRO-1 dépendent fortement du potentiel membranaire, la force motrice du mouvement des molécules chargées. L’ATP a également induit une assimilation de l’éthidium et du FITC de manière corrélative, bien que ces deux colorants portent des charges opposées. L’absorption d’éthidium induite par l’ATP a été réduite et, en revanche, l’absorption de FITC induite par l’ATP a été augmentée par la dépolarisation de la membrane. En outre, l’introduction d’une charge positive par mutation T348K ou la neutralisation d’une charge négative par D352N dans la petite voie de perméation d’ions a entraîné une diminution de l’absorption d’éthidium induite par l’ATP mais une augmentation de l’absorption de FITC induite par l’ATP. Enfin, MTSEA-biotine et MTS-rhodamine ainsi que MTSEA ont facilement modifié la cystéine en remplacement de G345, une position interne à la partie la plus étroite du canal ionique ouvert P2X7, et inhibé les courants ioniques induits par l’ATP et l’absorption d’éthidium. Ces résultats fournissent des preuves directes pour démontrer que le canal ionique P2X7 ouvert du rat peut pénétrer dans les grosses molécules. Cependant, pour ce faire, les canaux ioniques ouverts doivent être au minimum de 14 Å large. Ceci est notablement plus large que la voie de perméation d’ions dans les modèles à l’état ouvert des récepteurs P2X7 humains et de rats, soutenant la notion que le canal ionique ouvert se dilate (Virginio et al., 1999a, Browne et al., 2013). Détermination structurelle de la voie de perméation d’ions d’un récepteur P2X mammifères à l’état ouvert fournira la réponse clé à savoir si ou comment le canal d’ions ouvert permet le passage des colorants fluorescents.Parallèlement à ces efforts pour comprendre la formation de pores de grande taille P2X récepteur , des études ont accumulé des preuves pour montrer l’importance de cette fonctionnalité du récepteur. Par exemple, la formation de gros pores dépendants des récepteurs P2X7 a été identifiée comme un facteur crucial associé à des maladies comme la douleur chronique (Sorge et al., 2012), l’ostéoporose (Syberg et al., 2012) et l’atrophie géographique (Fowler et al. ., 2014). En outre, l’inhibition préférentielle de la formation de grands pores dépendante du récepteur P2X7 a été proposée dans une étude récente comme étant le mécanisme moléculaire soutenant l’activité anti-inflammatoire des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse, une classe de médicaments cliniquement prouvés (Fowler et al. 2014). Le ciblage sélectif de la formation de gros pores dépendant du récepteur P2X7 apparaît comme une intervention pharmacologique prometteuse et nouvelle (Jiang, 2015). Par conséquent, il devient de plus en plus intéressant et important d’obtenir un meilleur aperçu mécaniste de la formation de larges pores après l’activation des récepteurs P2X, en particulier des récepteurs P2X7.