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Contexte Depuis 2005, une augmentation de la prévalence de l’infection à Clostridium difficile due à la réaction de polymérisation en chaîne du ribotype 078 a été observée aux Pays-Bas. Cette souche a également été identifiée comme la souche prédominante chez les porcs et les veaux. Les isolats humains et porcins ont été étudiés plus avant et caractérisés par une analyse de répétition en tandem à nombre variable de multilocus. Résultats De février 2005 à février 2008, l’incidence du type 078 parmi les isolats obtenus de 1687 patients augmenté de 3% à 13% Comparé aux patients infectés par le type 027, les patients infectés par le type 078 étaient plus jeunes 674 vs 735 ans; P × 01 et plus souvent la maladie associée à la communauté 175% vs 67%; odds ratio, 298; Intervalle de confiance à 95%, 211-802; taux de diarrhée sévère 389% vs 400% et mortalité attribuable 38% vs 40% étaient similaires dans les deux groupes Comparés aux patients infectés par d’autres types, les patients infectés avec le type 078 recevaient plus fréquemment des fluoroquinolones 294% vs 198%; odds ratio, 217; Intervalle de confiance à 95%, 106-444 Les isolats de type 078 contenaient des gènes pour la toxine A, la toxine B, la toxine binaire et une délétion de 39 paires de bases dans le gène régulateur de la toxine tcdC, ainsi qu’une mutation ponctuelle à la position 184 codon Multilocus variable nombre répétition en tandem de 54 isolats humains et 11 isolats porcins a révélé 4 complexes clonaux contenant des isolats porcins et humainsConclusions CDI due au type 078 et CDI due au type 027 présent avec une gravité similaire, mais CDI due au type 078 affecte une population plus jeune et est plus fréquemment des isolats de C difficile de type 078 associés à la communauté chez les humains et les porcs sont fortement liés génétiquement

Infection à Clostridium difficile Le CDI peut se présenter comme une maladie sévère, en particulier lorsqu’il est provoqué par une souche hypervirulente caractérisée par le champ pulsé nord-américain de type 1, le groupe d’analyse par endonucléase de restriction de type BI et le ribotype 027 de PCR; cette souche a provoqué des éclosions d’ICD aux États-Unis, au Canada et en Europe [1-6] Les premiers cas signalés d’éclosions d’ICD dues au type 027 provenaient du Canada, où le Québec était le plus gravement touché. De plus, le Centre européen de prévention et de contrôle des maladies a signalé des infections dues au type 027 dans 16 pays européens [8]. La souche hypervirulente appartient au toxinotype III, héberge les gènes de la toxine tcdA et tcdB et des gènes de toxine binaire, et a une deletion de 18 paires de bases dans le gène régulateur de la toxine tcdC et une délétion à la position 117 Ce dernier entraîne un décalage de cadre et un codon stop prématuré, conduisant à une protéine TcdC tronquée. 027 est supposé être associé à des quantités plus élevées de production de toxines attribuables à un manque de contrôle réglementaire de la TcdC intacte [9, 10] Récemment, nous avons observé une augmentation de la prévalence de l’ICD humaine causée par le ribotype PCR 078, toxinotype V, qui a été rapporté comme le ribotype prédominant chez les veaux et les porcs [11] Aux Pays-Bas, le type 078 a également été trouvé dans les élevages porcins comme agent causal de la diarrhée chez les porcelets [12] CDI humain causé par le type 078, comparé au CDI causé par le type 027 et par le CDI causé par des types autres que 027 et 078 En outre, nous avons étudié les caractéristiques microbiologiques, les facteurs de virulence et la parenté des isolats humains et porcins de type 078

Méthodes

Définitions

Les définitions proposées par les Centres européens et américains de contrôle et de prévention des maladies ont été utilisées [13, 14] L’IDC associé aux soins de santé a été défini comme développement de l’ICD deux jours après l’admission à l’hôpital ou dans les quatre semaines après la sortie de l’hôpital. CDI a été définie comme le développement de l’ICD au jour 0, 1 ou 2 après l’admission à l’hôpital ou 12 semaines après la sortie de l’hôpital Lorsque le CDI s’est développé 4-12 semaines après la sortie de l’hôpital, l’association était indéterminée. ⩾3 selles non formées par 24 h Les patients étaient considérés comme ayant un IDC s’ils avaient la diarrhée et un échantillon de selles positif pour la toxine C et / ou B par un dosage en laboratoire. Un CDI compliqué était défini comme un IDC nécessitant une admission dans l’unité de soins intensifs. ou une intervention chirurgicale ou associée à la mort Une récidive a été définie comme un épisode survenant dans les 8 semaines après le début d’un épisode précédent. Une éclosion dans un fac Nous avons défini la diarrhée sévère comme une diarrhée sanglante et / ou une diarrhée avec une hypovolémie ou une hypoalbuminémie. Taux d’albumine, × 20 g / L, température de la fièvre,> 380 ° C et leucocytose WBC comptage,> 12 × 109 cellules / L, et / ou colite pseudomembraneuse La mortalité était considérée comme attribuable à l’ICD lorsqu’un patient mourait des conséquences de l’ICD pendant l’hospitalisation.

Collection de souches

Tous les isolats de C difficile qui ont été soumis au Laboratoire National de Référence au Centre Médical de l’Université de Leiden Leiden, Pays-Bas de janvier 2005 à janvier 2008 ont été inclus Cette collection comprenait 2 groupes La plupart des isolats 85% provenaient des soins de santé Les autres isolats provenaient d’établissements qui ne présentaient que des isolats provenant de patients atteints d’ICD sévère ou qui présentaient une incidence accrue de sélection aléatoire d’isolats humains du type 078 provenant d’autres pays. de Belgique n = 2, Italie n = 1, France n = 2, Allemagne n = 4, Royaume-Uni n = 1 et Irlande n = 1 Ces isolats étaient disponibles à partir d’une étude récente de Barbut et al [15] 078 isolats ont été obtenus à partir d’une collection de 11 isolats de porcs provenant de 2 fermes situées dans le centre et l’est des Pays-Bas avec des porcs ayant présenté une diarrhée néonatale pour & g t; 1 an Dans cette collection, le type 078 était le type exclusivement trouvé [12]

Analyse clinique

Collecte de données cliniques et démographiques Un questionnaire standardisé a été conçu pour obtenir des informations sur l’âge, le sexe, l’unité de diagnostic, l’ICD, la sévérité de la diarrhée, l’évolution clinique et la mortalité des patients. sur les hospitalisations et l’utilisation d’antibiotiques au cours des 3 mois précédant l’établissement de la comorbidité CDI selon la Classification internationale des maladies, dixième révision Les microbiologistes médicaux ont été invités à fournir ces données cliniques ainsi que la soumission de chaque isolat fécal au Laboratoire national de référence. la répartition des facteurs de risque et des paramètres cliniques chez les patients atteints d’ICD due au type 078 a été comparée à celle chez les patients atteints d’ICD due au type 027 et chez les patients atteints d’ICD due à des types autres que 027 et 078. analyses de variance Un test Y2 corrigé par Yates a été utilisé pour analyse des proportions Si une valeur de cellule était × 5 dans le tableau 2-par-2, le test exact de Fisher a été utilisé Un modèle de régression logistique multiple a été utilisé pour étudier l’association des facteurs de risque putatifs avec CDI dû au type 078 et CDI 027 Les risques relatifs ont été estimés en OR et présentés avec des IC à 95%. Les risques relatifs bruts et les risques relatifs après ajustement pour les facteurs confusionnels possibles sont fournis. Tous les facteurs de risque ont été ajustés pour l’âge, le sexe et les facteurs de confusion. la variable cible avec un P≤20 univarié Toutes les analyses ont été effectuées en utilisant SPSS pour Windows, version 130 SPSS

Analyse microbiologique

Isolement et caractérisation de C difficile Tous les isolats ont été identifiés génétiquement comme C difficile par PCR interne pour la présence du gène gluD codant pour la glutamate déshydrogénase spécifique du C difficile [16] Toutes les souches de C difficile ont été étudiées par ribotypage PCR [17] et toxinotypage [18] La présence de gènes de toxine tcdA, tcdB et binaire a été étudiée selon des techniques standardisées [19-21] Les délétions dans tcdC ont été déterminées par PCR en utilisant des amorces conçues en interne [22] Séquençage oftcdC Séquençage sélection aléatoire des souches humaines et porcines de type 078 Pour l’amplification de la tcdC, une amorce directe conçue à l’interne a été utilisée: 5 ‘TTT-TCATATGTTTTCTAAAAAAAA-TGA-GGG 3’ TcdC1s L’amorce inverse a été développée par Cohen et al [23] : 5 ‘GCA-CCTCATCACCATCTT-CAA 3’ 957 CDas Les réactions de PCR ont été réalisées avec la polymerase Pfu, en utilisant des conditions standard endométriose. Des produits PCR purifiés ont été utilisés comme matrices dans la réaction de séquençage du cycle Les données générées ont été analysées avec le test Vector NTI, version 10 InvitrogenAntimicrobial test de sensibilité Une sélection aléatoire des isolats de type 078 a été testée pour la présence du gène ermB, qui confère une résistance à la clindamycine et à l’érythromycine. -les tests bioMérieux ont été réalisés pour déterminer les CMI de la ciprofloxacine, de la moxifloxacine, de l’érythromycine et de la clindamycine, en utilisant les points de rupture décrits ailleurs [15] Multi-focalisation en tandem répétée MLVA Le génotypage moléculaire par MLVA a été réalisé pour une sélection aléatoire des souches 078 ailleurs [25], avec 1 altération: une nouvelle amorce inverse a été développée pour le marqueur CdG8 5 ‘ACC-AAAAATTTCTAACCC-AAC 3’ Une analyse de l’arbre recouvrant minimum des types MLVA a été réalisée pour déterminer la distance génétique entre isolats, en utilisant le nombre de locus différents et la différence de répétition en tandem sommé STRD en tant que coefficients pour la distance génétique dans BioN Umerics, version 46 Mathématiques appliquées A Goorhuis, MC Legaria, RJ Van den Berg, C Harmanus, ASC Klaassen, JS Brazier, G Lumelsky, EJ Kuijper, données non publiées [25, 26] Des isolats avec un STRD ≤ 10 ont été définis comme génétiquement apparentés. Les complexes clonaux ont été définis par un STRD ≤2 [26]

Résultats

De février 2005 à février 2008, nous avons reçu des isolats de 2039 patients atteints d’ICD; les isolats de 1687 patients étaient disponibles pour un typage ultérieur. Seul le premier isolat par patient a été analysé. Les isolats provenaient de 75 établissements de soins de santé, dont 49 hôpitaux et 1 400 isolats; 83%, 14 maisons de soins infirmiers 34; 2% et 12 laboratoires régionaux 253; 15% Les types les plus fréquemment rencontrés étaient 027 dans 289 isolats; 17%, 014 173; 10%, 078 150; 9% et 001 29; 2% Pendant la période d’étude, la proportion d’isolats du type 078 est passée de 3% à 13% et la proportion d’isolats du type 027 est passée de 27% à 1% Au cours du second semestre 2007, le type 078 était le deuxième Le type fréquemment rencontré dans 39 [13%] des 308 isolats, après le type 014 41 [113%] de 308 éclosions d’ICD dues au type 027 est survenu dans 14 établissements, alors que des cas sporadiques ont été détectés dans 20 établissements. Une ICD due au type 078 chez 4 patients a été observée dans une maison de retraite du nord-est des Pays-Bas. Un total de 27 cas sont survenus dans un autre hôpital; cependant, les cas n’étaient pas épidémiologiquement liés. Des cas sporadiques ont été trouvés dans 37 autres établissements. La propagation de l’IDC due aux types 027 et 078 est illustrée dans la figure 1 Les deux types étaient les plus fréquemment rencontrés dans la partie occidentale et centrale du pays. a montré une plus large distribution dans les zones plus périphériques et rurales

Figure 1View largeDownload slideSpread du PCR ribotype 027 à travers les Pays-Bas B, propagation du PCR ribotype 078 à travers les Pays-Bas Les cercles représentent les établissements de santé où l’infection par Clostridium difficile due au type respectif était endémique, et les étoiles représentent les établissements ayant connu des flambées de CDI dues Pays-Bas B, propagation de la PCR ribotype 078 à travers les Pays-Bas Les cercles représentent les établissements de soins de santé où l’infection par le Clostridium difficile due au type respectif était endémique et les étoiles représentaient des établissements ayant connu des éclosions. de CDI en raison du type respectif

Analyse clinique

Nous avons reçu des questionnaires de 715 42% des 1687 patients avec CDI; les questionnaires provenaient de 57 38% des 150 patients atteints d’ICD dus au type 078, 129 45% des 289 patients atteints d’ICD due au type 027, et 529 42% des 1248 patients atteints d’ICD dus à des types autres que 078 et 027. les facteurs de risque et les résultats de l’IDC attribuable aux types 078, 027 et autres types que 078 et 027 sont indiqués. Les différences entre les groupes sont exprimées en pourcentage du nombre total de patients pour lesquels l’information était disponible. les comparaisons suivantes étaient statistiquement significatives dans le tableau d’analyse multivariée 2

Tableau 1View large slideDownload Facteurs de risque et résultats de l’infection à Clostridium difficile CDI, par PCR ribotypeTable 1View large slideTéléchargement Facteurs de risque et résultats de l’infection à Clostridium difficile CDI, par PCR ribotype

Tableau 2View largeTélécharger des analysesUnivariées et multivariées des facteurs de risque et des paramètres de résultats pour lesquels des différences statistiquement significatives ou des tendances entre les 3 groupes de patients avec infection à Clostridium difficile CDI ont été trouvées Tableau 2Voir grandDifférentes analyses des variables de risque et paramètres de résultats pour lesquels statistiquement différences significatives ou tendances entre l’un des 3 groupes de patients avec infection CDI Clostridium difficile ont été trouvésComparaison de CDI due au type 078 et CDI due à des types autres que 078 et 027 Comparé aux patients avec CDI due à des types autres que 078 et 027, patients Comparaison avec les CDI dus au type 078 Comparativement aux patients avec CDI du type 027 Comparativement aux patients avec CDI du type 027, les patients avec CDI dû au type 078 étaient plus jeunes plus bas. pourcentage de patients était âgé de 80 ans et plus freq L’incidence des diarrhées sévères et de la mortalité attribuable était similaire dans les deux groupes de patients. Les patients atteints d’ICD de type 078 avaient moins souvent un Comparaison avec les patients avec CDI due à des types autres que 078 et 027 Comparativement aux patients avec CDI dû à des types autres que 078 et 027, les patients avec CDI dû au type 027 étaient plus âgés un pourcentage plus élevé de patients avec CDI dû au type 027 les patients avaient 65 ans et plus avaient des CDI associés aux soins de santé en raison du type 027 recevaient plus fréquemment des céphalosporines, des céphalosporines de deuxième génération et des fluoroquinolones et moins fréquemment des macrolides, de la clindamycine et des aminoglycosides. patients atteints de CDI due au type 027 que chez les patients atteints de CDI en raison de types autres que 078 et 027 une évolution compliquée, la mortalité globale, la mortalité attribuable et les récidives étaient significativement associées à l’ICD due au type 027 en analyse univariée, aucune de ces différences n’étant statistiquement significative dans l’analyse multivariée

Analyse microbiologique

Une sélection aléatoire de 51 isolats de type 078 humains et 8 porcins était disponible pour l’étude de tcdA et tcdB, de gènes de toxine binaire, de toxinotypage, de séquençage de tcdC et de tests de sensibilité. Tous ces gènes contenaient des gènes tcdA, tcdB et binaires. toxinotype V Séquençage de tcdC identifié dans tous les isolats une délétion de 39 paires de bases des nucléotides 341 à 379 et une mutation ponctuelle à la position 184 C184T, entraînant un arrêt prématuré du codon TAA Test de sensibilité a été réalisée sur 49 isolats, car 2 isolats humains ont été De ce nombre, 46 94% étaient résistants à la CMI de la ciprofloxacine, ⩾4 mg / L, et 38% étaient résistants à l’érythromycine CMI, ⩾4 mg / L. Quarante-trois isolats 88% étaient sensibles à la moxifloxacine CMI, × 4 mg / L, et 28 57% étaient sensibles à la CMI de la clindamycine, × 4 mg / L Le gène ermB a été trouvé chez 7 14% des 49 isolats Aucune différence statistiquement significative dans la sensibilité aux antimicrobiens n’a été trouvée entre les isolats humains et porcins. La collection de 51 isolats a été élargie avec 11 isolats humains de type 078 / toxinotype V disponibles dans d’autres pays et 3 autres isolats porcins de type 078 / toxinotype néerlandais; La figure 2 montre l’analyse de Spanning Tree minimale de ces 65 isolats. Tous étaient génétiquement liés STRD, ≤ 10, et 4 complexes clonaux CCs avec un STRD ≤2 ont été identifiés en boîte CC-A CC-D CC-A et CC-B contenaient tous deux des isolats humains et porcins Huit 73% de 11 isolats porcins ont été trouvés dans ces 2 CC Les 3 isolats porcins restants étaient homologues à 100% et étaient apparentés à CC-B Of 14 isolats humains appartenant à CC-A et CC-B, 4 provenaient d’autres pays ITA1 dans CC-A et GBR1, BEL1, et GER2 dans CC-B

Figure 2View largeTélécharger la diapositive Analyse de l’arbre couvrant 65 isolats de Clostridium difficile type 078 54 isolats humains et 11 isolats porcins typés par analyse de répétition en tandem à nombre variable multilocus MLVA Les isolats porcins sont en caractères gras et commencent par «P»; Parmi les 54 isolats humains, 11 proviennent de pays autres que les Pays-Bas. Les pays sont Belgique BEL, Allemagne GER, Italie ITA, France FRA, Royaume-Uni GBR et Irlande IRE Chaque cercle représente soit un isolat unique, soit isolats homologues à 100% Les nombres entre cercles représentent la différence de répétition en tandem sommé STRD entre types MLVA Dans l’arbre couvrant, 4 complexes clonaux en boîte CC-A à CC-D avec un STRD ≤2 sont représentés Figure 2View largeTélécharger la diapositive Analyse d’arbre recouvrant minimum de 65 isolats de Clostridium difficile type 078 54 isolats humains et 11 isolats porcins typés par analyse de répétition en tandem à nombre variable multilocus MLVA Les isolats porcins sont en caractères gras et commencent par «P»; Parmi les 54 isolats humains, 11 proviennent de pays autres que les Pays-Bas. Les pays sont Belgique BEL, Allemagne GER, Italie ITA, France FRA, Royaume-Uni GBR et Irlande IRE Chaque cercle représente soit un isolat unique, soit isolats 100% homologues Les nombres entre cercles représentent la différence de répétition en tandem sommée STRD entre les types de MLVA Dans l’arbre couvrant, 4 complexes clonaux en boîte CC-A à CC-D avec un STRD ≤2 sont représentés

Discussion

Dans la partie orientale du pays, où 90% de toutes les exploitations porcines sont situées Ici, le type 078 a été trouvé dans 224% de tous les isolats soumis Il est tentant de supposer que ce chevauchement est attribuable à une source commune d’isolats humains et porcins , mais les données de surveillance sur les élevages porcins font défaut, et une transmission zoonotique n’a jamais été démontrée Tous les isolats de type C difficile 078 appartenaient au toxinotype V; avaient des caractéristiques de virulence similaires à celles du type 027, telles que la présence de gènes tcdA, tcdB et de toxines binaires; et avait une mutation C184T dans le gène régulateur tcdC qui a abouti à un codon stop prématuré Cette mutation dans les souches toxinotype V a été rapportée ailleurs [29, 30] mais n’a jamais été attribuée au type 078 Les profils de sensibilité aux antimicrobiens du type 078 différaient de ceux de type 027; 88% des isolats du type 078 étaient sensibles à la moxifloxacine, 43% étaient résistants à la clindamycine et 14% abritaient le gène ermB. Notre étude a quelques limites. Premièrement, tous les établissements de santé néerlandais n’ont pas soumis d’isolats. 4 laboratoires régionaux ont régulièrement soumis des isolats sur une base mensuelle, et 15% seulement ont soumis des isolats provenant de patients avec CDI sévère ou quand il y avait une incidence accrue de CDI Pour enquêter sur les biais potentiellement introduits, ces 2 sous-groupes ont été analysés séparément. Nous avons estimé le nombre attendu d’ICD des 13 hôpitaux qui soumettaient régulièrement des échantillons sur la base des registres d’admission disponibles sur les sites Web des hôpitaux et de l’incidence de l’ICD par hôpital ou, si ce n’était pas le cas. connu, l’incidence moyenne signalée aux Pays-Bas [16] En utilisant ces nombres attendus d’ICD, nous avons estimé que nous avions reçu 81 % de tous les isolats CDI de ces hôpitaux De même, en utilisant le nombre total d’hospitalisations aux Pays-Bas [31], nous avons estimé que nous avions reçu des isolats de 30% de tous les patients atteints de CDI aux Pays-Bas. pour seulement 715 42% des 1687 CDI La distribution des types 078, 027 et types autres que ceux-ci parmi 715 patients était, cependant, semblable à la distribution parmi les 1687 patients; la répartition de l’âge et du sexe était également similaire De plus, le résultat de la dactylographie n’était pas connu à l’avance; Une découverte remarquable a été que tous les isolats humains et animaux de type 078 étaient liés par MLVA au point de clonalité. Cette découverte soutient fortement l’hypothèse qu’il n’existe aucune barrière interspécifique pour le type 078 de CDI. La parenté génétique entre les isolats de type 078 est surprenante, car les études antérieures ont révélé une forte variation entre les types 017 et 027 [25, 32, 33] Ceci pourrait indiquer que le type 078 n’a pas fait partie du spectre de l’ICD humaine depuis assez longtemps de développer une relation plus éloignée avec les souches porcines ou très stable vis-à-vis des mutations. Ce dernier n’est pas probable, car Stabler et al [34] ont récemment révélé que le C difficile subissait facilement des échanges génétiques. que les souches humaines proviennent de celles trouvées chez les porcs sur la base de l’identification d’un clade toxinogène contenant des isolats porcins, bovins et humains. Killgore et al [35] ont récemment révélé que le MLVA et l’analyse des endonucléases de restriction ont un pouvoir discriminant supérieur à celui des autres méthodes de typage. Une question importante est: que faut-il faire? provoque l’émergence de la souche type 078. Une explication pourrait être l’augmentation de l’utilisation des fluoroquinolones par les patients atteints de CDI due au type 078. Cependant, comme 70% des patients avec CDI du type 078 n’utilisent pas de fluoroquinolones, ceci ne peut être la seule raison Il est probable qu’un autre mécanisme de sélection encore inconnu favorise l’émergence de ce génotype hypervirulent. Une autre explication pourrait être que le type 078 est issu de l’élevage bovin. Cette hypothèse est confirmée par le fait que le type 078 prédomine dans les échantillons diarrhéiques porcins et bovins. ], que C difficile a été trouvé dans la viande au détail avec 078 comme type prédominant dans 1 étude [36, 37], et que p Comme nous l’avons constaté dans notre étude, le lien entre les CDI humains et porcins a été récemment suggéré par Jhung et al. [38] En conclusion, comparé au CDI dû au type 027, le CDI type 078 provoque une maladie sévère dans une population plus jeune et provoque une fréquence plus élevée de maladies associées à la communauté Le spectre clinique et microbiologique du CDI type 078 suggère que, similaire au type 027, il est un nouveau souche hypervirulente qui est génétiquement indiscernable des souches porcines de type 078

Remerciements

Conflits d’intérêts potentiels EJK a servi dans les bureaux des conférenciers pour Genzyme et Toluamer Tous les autres auteurs: no conflicts